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    公开号:WO1981001153A1
    申请号:PCT/EP1980/000116
    申请日:1980-10-23
    公开日:1981-04-30
    发明作者:P Hofschneider；T Wong；Y Nicolau
    申请人:Max Planck Gesellschaft；
    IPC主号:A01K67-00
    专利说明:
    [0001] EUKARIOTISCHE ZELLEN UND PROTOPLASTEN MIT EINEN GEHALT AN DURCH
    [0002] LIPIDVESIKEL EINGEBRACHTER DNA.
    [0003] Die Erfindung betrifft eukaryotische Zellen, eukaryotische Protoplasten und vielzellige eukaryotische lebende Organis¬ men mit einem Gehalt an durch Lipidvesikel eingebrachter DNA, die die genetische Information in Form nützlicher Gen- Produkte expri ieren können,- Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Herstellung von Gen-Produkten, zur Immunisierung und zur Behebung genetisch bedingter Defekte.
    [0004] Lipidvesikel stellen annähernd kugelförmige Gebilde dar, deren Wandung aus einem System von mindestens einer Membran aus Lipidmolekülen besteht. Zur Zeit sind drei verschiedene Arten von Lipidvesikeln bekannt, nämlich multilamellare Lipidvesikel (MLV) , auch als Liposomen bezeichnet, kleine unilamellare Lipidvesikel (SUV) sowie große unilamellare Lipidvesikel (LUV) . Die Herstellung, die Eigenschaften und die Verwendung dieser Lipidvesikel ist u.a. von • D. Papahadjopoulos und W.J. Vail, Lipid Vesicles as
    [0005] Carriers for Introducing Biologically Active Materials into Cells, Methods in Cell Biology, Bd. 14 (1976) , S. 33 - 71, sowie R.E.Pagano und J.N.Weinstein, Ann. Rev. Biophys. Bioeng., Bd. 7 (1978) , S. 435 bis 468, beschrieben. In die¬ sen beiden Übersichtsartikeln ist auf umfangreiche weitere Literatur verwiesen worden.
    [0006] Es ist bekannt, daß Warmblüterzellen, z.B. Säugetierzellen, in vitro und in vivo eine große Anzahl von Lipidvesikeln ohne cytotoxische Wirkungen aufnehmen. Da die verschiedenst Stoffe im Inneren von Lipidvesikeln oder zwischen den Vesik membranen eingeschlossen werden können, kann die Aufnahme von Lipidvesikeln bestimmter Zusammensetzung durch Zellen eine Möglichkeit zur Modifizierung der zellulären Zusammen¬ setzung und zum Einführen nicht-permeabler biologisch akti¬ ver Stoffe in die Zelle eröffnen; vgl. G. Poste, D. Papahadjopoulos und W.J. Vail, a.a.O. und* G. Gregoriadis, The Carrier Potential of Liposomes in Biology and Medicine, The New England Journal of Medicine, Bd. 295 (1976) , S. 704 bis 710, und U.E. Pagano und J.N. Weinstein, a.a.O.
    [0007] So ist z.B. bekannt, Inositolhexaphosphat enthaltende uni¬ lamellare Lipidvesikel in das Zellinnere von Erythrocyten einzubringen; vgl. K. Gersonde und C. Nicolau, Blut, Bd. 39 (1979) , S. 1 bis 7. Ferner ist bekannt, daß Metaphase- Chromosomen, die das HGPRT-Gen bzw. das AMP-Pyrophosphat- Phosphoribosyltransferase-Gen (aprt ) tragen, mit Liposomen in Zellen überführt werden können, die HGPRT bzw. aprt-nega tiv sind. Die Überführung läßt sich durch Selektionierung der wenigen HGPRT bzw. aprt-positiv gewonnenen Zellen nach¬ weisen; vgl. A.B. Mukherjee u. Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 75 (1978) , S. 1361 - 1365, und M. Wigler u. Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 76 (1979) S. 1373 bis 1376. Es ist auch bekannt, daß Polioviren Typ I bzw. die replikationsfähige RNA dieser Viren mit Hilfe von Lipidvesikeln in Poliovirus-resistente Ovarienzellen des chinesischen Hamsters überführt werden. In diesem die Überführung durch Nachweis der Virusproduktion erbracht; vgl. T. Wilson u. Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 74 (1977), S. 3471 bis 3475, und T. Wilson u. Mitarb., Cell, Bd. 17 (1979), S. 77 bis 84.
    [0008] Auch die Boten-RNA (m-RNA) für Kaninchenglobin ist mit Lipid¬ vesikeln (LUV) in Mäuse-Milzlymphocyten überführt worden, in denen dann die Synthese von Kaninchenglobin zu beobachten ist; vgl. G.J. Dimitriadis, Nature, Bd. 274 (1978), S. 923 bis 924. Die Verwendung von RNA hat allerdings den Nachteil, daß sie schwer zu reinigen ist und in gereinigtem Zustand sehr viel leichter der Hydrolyse unterliegt als DNA.
    [0009] Das bakterielle selbst replikationsfähige Plasmid pBR322 kann mit Hilfe von Liposomen in E. coli eingeführt werden. Es repliziert sich in Ξ. coli und kann durch die Nachkommenbak¬ terien des Ξmpfängerbakteriums, die nun die Resistenz arker des pBR322 Plasmids zeigen, nachgewiesen werden; vgl. R.T. Fraley u. Mitarb., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Bd. 76 (1979), S. 3348 bis 3352. DNA-haltige Liposomen sind in den Kern der Protoplasten der Pflanze Vigna sinensis eingeführt worden; vgl. P.F. Lurquin, Nucleic Acids Research, Bd. 6 (1979), S. 3773 bis 3784. Es ist auch bekannt, daß Liposomen durch Injektion im lebenden Organismus zur Fusion mit Zellen dieses
    [0010] Organismus gebracht werden können. , /
    [0011] Der Einschluß von Plasmid-DNA (pMB9) in Lipidvesikel (LUV) ist ebenfalls bekannt; vgl. G.J.Dimitriadis, Nucleic Acids Research, Bd. 6 (1979), S. 2697 bis 2705. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eukaryotische Zell eukaryotische Protoplasten und vielzellige eukaryotische le¬ bende Organismen mit einem Gehalt an durch Lipidvesikel eing brachter einsträngiger oder doppelsträngiger DNA von Prokary onten oder Eukaryonten zur Verfügung zu stellen mit dem Ziel der unmittelbaren Gen--Expression, d.h. der Synthese von nütz lichen Gen-Produkten in den Zellen, und zwar in einer Menge, die deren einfache Erkennung, Anreicherung und Isolierung er möglicht. Im Unterschied zu bisherigen Verfahren der Gen- Überführung (Gen-Transformation) soll es erfindungsgemäß mög lich sein, die Gen-Produkte nach bekannten Methoden festzu¬ stellen und zu gewinnen, ohne daß die Zellen, welche die DNA-haltigen Lipidvesikel erhalten haben, von den übrigen Ze len selektioniert werden müssen. Außer den primären wertvol- len Gen-Produkten (Proteine in Form von Enzymen, Virusanti- gene, Peptidhormone, biologisch aktive Polypeptide usw.) sollen auch sekundäre Gen-Produkte gewonnen werden können, die durch die enzy atische Leistung der primären Gen-Produkt wie z.B. Enzyme, synthetisiert werden.
    [0012] Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eukaryotische Zei Linien zur Verfügung zu stellen, die nicht nur unmittelbar, sondern durch stabile Inkorporation der mittels Lipidvesikel eingeführten DNA auf die Dauer in Form ihrer Nachkommenzelle bestimmte wertvolle Gen-Produkte synthetisieren.
    [0013] Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, durch Einführung von DNA mittels Lipidvesikeln in vielzellige eukaryotische l bende Organismen ohne deren Integrität durch größere Eingrif fe zu gefährden, die Produktion bestimmter Gen-Produkte zu veranlassen, z.B. die Bildung von Antigenen zwecks "Selbst¬ immunisierung" / die Bildung von Antikörpern, oder die Bildu von Gen-Produkten zur zeitweiligen oder bleibenden Behebung genetisch bedingter Mängel, Defekte oder Krankheiten.
    [0014] OMPI Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, DNA enthaltende Lipidvesikel in das Cytoplasma von eukaryotisehen Proto¬ plasten aus Pflanzen einzuführen, um auf diese Weise in der Pflanze wertvolle Produkte, z.B. Proteine, zu bilden und nach Überführung der DNA in den Zellkern durch zell¬ eigene Mechanismen zu genetisch neuen Pflanzenrassen zu ge¬ langen. Auch Saccharomyces cerevisiae und Neurospora crassa und deren Protoplasten mit einem Gehalt an durch Lipidvesikel eingebrachter DNA können erfindungsgemäß zur Verfügung gestellt werden.
    [0015] Es wurde völlig überraschend festgestellt, daß nach dem Einführen von DNA mittels Lipidvesikel in das Cytoplasma von eukaryotischen Zellen, d.h. isolierte Zellen pflanzli¬ chen, tierischen oder menschlichen Ursprungs, eukaryotische Protoplasten oder Zellen von vielzelligen eukaryotischen lebenden Organismen, unmittelbar, nämlich innerhalb weniger Stunden die Produktion der entsprechenden Gen-Produkte festzustellen ist. Ebenso überraschend ist, daß es nach dem Einbringen von DNA-haltigen Lipidvesikeln in vielzellige eukaryotische lebende Organismen im Organismus innerhalb kurzer Zeit zur Produktion der entsprechenden Gen-Produkte kommt. Es war bisher nicht bekannt, daß DNA aus prokaryoti- schen oder eukaryotischen Quellen in eukaryotischen Systemen sofort und unmittelbar nach dem Einbringen der DNA-haltigen Lipidvesikel, zur Expression gebracht werden konnte. Der Me¬ chanismus der Transkription und Translation von DNA in pro- karyotischen und eukaryotischen Systemen ist nocht nicht voll¬ ständig aufgeklärt.
    [0016] Als eukaryotische Zellen kommen für die Erfindung praktisch alle üblichen Zellen und Zeil-Linien unterschiedlichen Ur- in Betracht sprungs', wie HeLa-Zellen (Mensch) , L-Zellen (Maus) , Rous
    [0017] Sarcom-Zellen (Huhn) , Vero-Zellen (Affe) , Nieren-Zellen
    [0018] (Affe, Rind, Schwein) sowie primäre Zellkulturen, die direkt aus beliebigen Organismen, wie z.B. Maus, Ratte, Huhn, Affe,
    [0019] Wachtel, Hamster, Kaninchen, Rind oder Schwein, gewonnen werden. Besonders bevorzugt sind diploide Zellen, die in G webekulturen möglichst hohe Generationszahlen erreichen. E so kommen in Frage Zellen und Protoplasten aus z.B. Tabaks pflanzen, Getreidepflanzen, Saccharomyces cerevisiae oder Neurospora crassa. Als vielzellige eukaryotische lebende Organismen kommen Pflanzen, Tiere oder Menschen in Frage.
    [0020] Als DNA-Material aus prokaryotischen oder eukaryotischen Quellen kommen biochemisch gereinigte Gesamt-DNA einer Zel le oder eines Organismus, insbesondere aber hieraus ange¬ reicherte Fraktionen (Gen-Fragmente) in Frage. Einsträngi- ge und doppelsträngige DNA, insbesondere spezifische DNA, steht heute nach Replikation in Plasmiden, Phagen oder Viren in belieb gen Mengen zur Verfügung. Vorzugsweise kann Plas id- und Virus ' DNA (Vektoren) verwendet werden, die ihrerseits wiederum bestimmte Spender-DNA aus anderen Organismen beinhalten kann. Dieses Verfahren kommt insbesondere deshalb in Frage weil hierdurch gewünschte DNA angereichert werden kann. In besondere kommen aus den Vektoren herausgeschnittene Gen- Fragmente in Frage, welche codogene DNA-Sequenzen für das gewünschte Gen-Produkt enthalten. Es ist keine notwendige Voraussetzung für die Erfindung, daß die in den Lipid¬ vesikeln eingebrachte DNA nach der Fusion mit dem Zellen oder den Zellen lebender Organismen die Fähigkeit zur Selbstreplikation hat. DNA kann auch mittels reverser Tran kription aus RNA hergestellt werden. Es ist ebenfalls mög¬ lich, chemisch hergestellte DNA-Sequenzen entweder für sic allein oder nach Kopplung an natürliche oder auf andere We se gewonnene DNA, z.B. in Plasmiden, zu verwenden.
    [0021] Die Herstellung der DNA-enthaltenden Lipidvesikel und ihr Einbringen in eukaryotischen Zellen, eukaryotische Proto¬ plasten und vielzellige eukaryotische lebende Organismen erfolgt nach üblichen bekannten Methoden. Insbesondere wer den Lipidvesikel nach den von G. Poste, D. Papahadjopoulos und W.J. Vail, a.a.O., sowie R.E. Pagano und J.N.Weinstein
    [0022] ( O a.a.O., angegebenen Verfahren in die Zellen, Protoplasten oder Organismen eingebracht. Vielzellige eukaryotische lebende Organismen, wie Tiere und Menschen, werden DNA enthaltende Lipidvesikel durch parenterale Injektion, bei- spielsweise intravenös, intramuskulär, subkutan, intra- peritoneal oder durch Injektion in bestimmte Organe, z.B. intratestikulär, appliziert. In Pflanzen können die DNA- haltigen Lipidvesikel in die Gefäßesystemisch, z.B. die Leitbündel oder Siebröhren, eingebracht werden.
    [0023] Mit den Zellen können nach der Fusion mit DNA-haltigen Lipidvesikeln wertvolle primäre •Gen-Produkte, wie Antikör¬ per, Enzyme, wie ß-Lactamase, zelluläre, bakterielle oder virale Antigene, wie Tumorantigene, H-Antigene der Salmonel- leή, Oberflächenantigen des Hepatitis B Virus (HBsAg) , Anti¬ gene von Tollwut-Virus oder Maul- und Klauenseuche-Virus, hergestellt werden. Es können im Prinzip auch Produkte hergestellt werden, die durch die hinterein¬ ander geschaltete Syntheseleistung eines oder mehrerer Enzyme gebildet werden, deren genetische Information durch die Lipidvesikel in die Zellen verbracht wurde. Dasselbe gilt analog für vielzellige Organismen, deren Zellen mit DNA-haltigen Lipidvesikeln zur Fusion gebracht wurden.
    [0024] Was die Zellen betrifft, so kommen folgende Anwendungen in Frage: a) In erster Linie die Möglichkeit, das gewünschte Gen- Produkt sofort zu synthetisieren, ohne daß sich die ein¬ gebrachte DNA selbst replizieren muß, und "ohne daß die Replikation und Vermehrung dieser Zellen abgewartet wer¬ den muß; b) infolge der hohen Effizienz des DNA-Transfers durch Lipidvesikel können leicht Zellen isoliert werden, wel¬ che die DNA so in ihrem Genom verankert haben, daß die DNA erblich weitergegeben werden kann und zur ständigen Synthese des gewünschten Gen-Produktes führt. Nach dem
    [0025] Oi PI •t -- -> V t/r IuPrOv-- « bisherigen Stand der Wissenschaft, d.h. bei den übliche Transformations-Verfahren, wäre höchstens zu erwarten, daß eine unter etwa 1 Millionen Zellen die gewünschte neue Eigenschaft enthält.
    [0026] Was vielzellige lebende Organismen betrifft, so können z.B
    [0027] Tiere zur Bildung von Antikörpern gegen Krankheiten ge¬ bracht werden, die durch Parasiten, Bakterien oder Viren verursacht w den. Im Bereich der Humanmedizin können Erbdefekte, wie Galactosämie, Lesch-Nahan-Syndrom, Ahorn-Syrup-Krankheit,
    [0028] Hyperargininaemi , Hämophilie A und B oder Muskeldystrophi behandelt werden. Ebenso können Krankheiten, deren Behand¬ lung die intrazelluläre Synthese von Proteinen im Organis¬ mus selbst erforderlich macht, therapiert werden. Durch Fusion von Zellen eines lebenden eukaryotischen Organismus mit DNA-haltigen Lipidvesikeln kann ein Mangel an einem Pr tein, z.B. einem Peptidhormon oder einem Enzym, beseitigt oder der Schutz gegen virale Infektion (durch Interferon¬ produktion) erhöht werden.
    [0029] Das Verfahren zur Herstellung der DNA-haltigen Lipidvesike besteht im allgemeinen darin, daß bei üblichen pH-Werten, vorzugsweise einem pH-Wert von etwa 7, in wäßrige Lösungen bei Temperaturen, bei denen Lipidvesikel stabil sind, vor- zugsweise um 35 bis 37°C, wasserunlösliche polare Lipide (sogenannte a phipathische Lipide) , z.B. Phospholipide, entweder allein oder als Lipidgemisch, wie ein Phospho- lipid, häufig Ξilecithin, Cholesterin und ein elektrisch geladenes A phiphil, wie Stearylamin (positive Ladung) oder Dicetylphosphat (negative Ladung), in unterschiedliche Molverhältnissen, gewöhnlich im Bereich von 6 : 3 : 1 bis 5 : 5 : 0,5, mit DNA-Material gemischt werden. Sodann werd anschließend, z.B. durch Ultraschall-Behandlung, Lipidve¬ sikel gebildet, die ohne weiteres Zutun das DNA-Material einschließen. Der erhaltenen DNA-haltigen Lipidvesikel- suspension werden erfindungsgemäß eukaryotische Zellen ode Zellkulturen oder eukaryotische Protoplasten als Kulturen zugesetzt. Diese werden nach Routinemethoden angelegt. Vor der Zugabe der DNA-haltigen Lipidvesikelsuspension wird das Kulturmedium teilweise oder ganz entfernt. Nach einer Anzahl von Stunden wird wiederum die Lipidvesikellö- sung entfernt und neues Kulturmedium zugegeben. Nach etwa 16 bis 24 Stunden kann in den Zellen bzw.. Protoplasten eine hinreichende Menge des gewünschten Gen-Produktes nachgewiesen werden.
    [0030] Als Nachweismethoden für die synthetisierten Gen-Produkte kommen bekannte Verfahren, wie mikrobiologischer Nachweis, Spekralphotomεtrie, radioimmunologische, virologische und enzymatische.Verfahren in Frage. Alle diese Verfahren sind in wissenschaftlichen Standarkwerken veröffentlicht. Als Isolierungs- und Reinigungsmethoden für die Gen-Produkte kom¬ men ebenfalls bekannte Verfahren, wie Chromatographie, Aus¬ salzung, Elektrophorese oder Reaktion mit Antigenen oder "Antikörpern, in Frage. Auch diese Verfahren sind in wissen¬ schaftlichen Standardwerken veröffentlicht.
    [0031] Zur Immunisierung von Tieren und Menschen oder zur Produk¬ tion von Antigenen oder Antikörpern können die DNA-haltigen Lipidvesikel in Form üblicher Injektionspräparate nach üb¬ lichen Methoden parenteral appliziert werden, z.B. subkutan, intravenös, intramuskulär oder intraperitoneal. Die DNA- haltigen Lipidvesikel können auch unmittelbar in Organe injiziert werden. Es ist klar, daß die Herstellung der DNA- haltigen Lipidvesikelpräparate ' in diesem Fall unter steri¬ len Bedingungen erfolgen muß. Injektionspräparate enthalten eine ausreichende Menge der gewünschten DNA-haltigen Lipid¬ vesikel in üblichen Verdünnungsmitteln, z.B. physiologischer Kochsalzlösung. Die DNA-haltigen Lipidvesikelpräparate können ein einziges Mal oder in einem Abstand von Stunden oder Tagen mehrmals injiziert werden. Die verwendete Menge der DNA-haltigen Lipidvesikel, die Tier oder Mensch appli¬ ziert wird, ist so bemessen, daß die gewünschte Immunisie¬ rung oder die Produktion von Antigenen oder Antikörpern zur Isolierung und Gewinnung ausreichender Mengen erfolgt. Die Beispiele erläutern die Erfindung.
    [0032] B e i s p i e l 1 10 μMol Phosphatidylcholin (gereinigt nach W.S. Singleton u. Mitarb. , Journal of American Oil Chemist's Society, Bd. 42 (1965), S. 53) und Phosphatidylserin hoher Reinheit aus Rinderhirn im Molverhältnis 9 : 1 werden in 10 ml Chlo form p.a. gelöst. Die erhaltene Lösung wird im Stickstoff- ström bei 36°C zur Trockene eingedampft.
    [0033] 2 μg DNA des ß-Lactamase-Gens (vgl. J.G. Sutcliffe, Proc. Natl. Acad. Sei. USA , Bd. 75 (1978), S. 3737 bis 3741) werden in 10 ml eines wäßrigen Tris-Histidin-NaCl-Puffers (25 M Tris-HCl, 2 M Histidin, 145 mM NaCl; pH 7,4) gelös Die erhaltene Lösung wird zu den Lipiden gegeben und das G misch wird 30 Minuten bei 35°C unter Stickstoff als Schutz gas mit einem Branson-UltraschalIgerät Typ B-12 derart mit Ultraschall behandelt, daß kein wesentlicher Abbau der DNA erf
    [0034] Die erhaltene DNA-haltige Lipidvesikelsuspension wird nun
    [0035] 2 Stunden bei 37°C mit HeLa-Zellen inkubiert. Zu diesem
    [0036] Zweck werden die HeLa-Zellen zunächst mit 20 ml Eagle's
    [0037] Minimal Essential. Medium(EMEM) ohne Serum gewaschen. Sodann werden 4 ml der DNA-haltigen Lipidvesikelsuspension (10μMo
    [0038] 7 zu 10 gewaschenen HeLa-Zellen gegeben.
    [0039] Nach der Inkubation wird die Lipidvesikelsuspension von de HeLa-Zellen dekantiert. Die Heia-Zellen werden zweimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und so dann mit 20 ml EMΞM versetzt, das 10 % foetales Kälberseru enthält.
    [0040] In gleicher Weise werden anstelle von HeLa-Zellen Hühner- embryo-Fibroplasten sowie in einem weiteren Versuch L-Zell in gleicher Menge verwendet. Die Genexpression in den HeLa-Zellen, Fibroplasten und L-Zel¬ len wird spektrophotometrisch sowie mikrobiologisch verfolgt.
    [0041] 7 Nach 16 bis 24stündiger Inkubation bei 37°C werden 10 Zellen in üblicher Weise trypsinisiert, sodann bei 270 x g zentri- fugiert. Der erhaltene Niederschlag (das "Pellet") wird zum Aufbrechen der Zellen mit Ultraschall behandelt'.
    [0042] -4 Aliquots des Zellextrakts werden mit 10 molarer Cephalo- sporin 87/312 Lösung, d.h. einer Lösung, die 51,6 μg/ml des Cephalosporins enthält (vgl. C.H. O'Callaghan u. Mitarb., Novel Method for Detection of ß-Lactamases by Using a Chromogenic Cephalosporin Substrate, Antimicrobial Agents and Che otherapy, Bd. 1 (1972) , S. 283 bis 288), 30 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Änderung der Absorptions¬ spektren der Reaktionsgemische wird mit einem Cary 17 Spektrophotometer aufgezeichnet. Das Maximum bei 386 nm nimmt ab und gleichzeitig erscheint ein neues Maximum bei 482 nm. Dies ist ein Beweis für das Vorliegen von ß-Lactamase im Reaktionsgemisch, die den ß-Lactamring des Cephalosporins geöffnet hat. .
    [0043] Der mikrobiologische Test zur Bestimmung der Anwesenheit von ß-Lactamase, für die das- Gen codiert, wird folgendermaßen durchgeführt:
    [0044] 10 Ampicillin-empfindliche Zellen von E.coli C 600 werden mit 0,5 ml des Zellextrakts in Gegenwart von 30 μg/ml Ampicillin 15 bis 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Ampicillin-e pfindlichen Zellen vermehren sich stark im Medium. Dies ist ein Beweis für die Anwesenheit des Gen- Produkts ß-Lactamase, das den ß-Lactamring des Ampicillins geöffnet und dadurch das Antibiotikum inaktiviert hat.
    [0045] B e i s p i e l 2 Beispiel 1 wird wiederholt, jedoch werden anstelle der DNA des ß-Lactamase-Gens 2 μg des DNA-Fragmentes verwendet, das die für HBsAg codierenden DNA-Sequenzen enthält. Die erhaltene DNA-haltige Lipidvesikelsuspension wird zu HeLa-Zellen bzw. zu Hühnerembryofibroplasten gegeben.
    [0046] OMPI " V/IP Nach mindestens 18stündigem Inkubieren der behandelten Zel¬ len bei 37°C wird das Kulturmedium mittels des Radioimmun- tests auf die Gegenwart von HBsAg untersucht. Das Ergebnis des Radioimmuntests zeigt die Gegenwart von HBsAg an.
    [0047] Das DNA-Fragment, das die für HBsAg codierende DNA enthält, kann nach der von P.Valenzuela u. Mitarb., Nature, Bd. 280 (1979), S. 815 bis 819, beschriebenen Methode, erhalten werde .
    [0048] Das HBs-Antigen kann durch bekannte biochemische Verfahren z.B. Sedimentation oder Dichtegradientenzentrifugation,ge¬ reinigt werden.
    [0049] B e i s p i e l 3
    [0050] Beispiel 2 wird wiederholt, jedoch wird als DNA ein Plasmid verwendet, welches das Gen für das Hepatitis core Antigen (HBcAg) enthält.
    [0051] Das Ergebnis des Radioimmuntests zeigt die Gegenwart von HBcAg an.
    [0052] In gleicher Weise können Plasmide verwendet werden, welche Gene für Wachstumshormone, Insulin, Somatostatin (chemisch synthetisierte codogene Sequenzen) , Angiotensin II oder
    [0053] Interferon enthalten. Durch den Radioimmuntest oder geeigne te biologische Verfahren lassen sich diese Gen-Produkte nach kurzer Zeit nachweisen.
    [0054] B e i s p i e l 4
    [0055] Produktion von HBsAg in Kaninchen
    [0056] Gemäß Beispiel 2 hergestellte Lipidvesikel, die die für HBsAg codierende DNA enthalten, werden in 4 ml physiologi- scher Kochsalzlösung suspendiert und Kaninchen intravenös in die Ohrvene injiziert. Bis zum 7. Tag werden täglich
    [0057] OM IF Serumproben entnommen. Außerdem werden an ausgewählten Tagen Tiere getötet und Leberproben untersucht. Aus den Leberproben wird das Cytoplasma nach bekannten Methoden gewonnen. Im Radioimmuntest läßt sich das HBs-Antigen nachweisen.
    [0058] Der Hauptzweck dieses Verfahrens ist allgemein betrachtet, darin zu sehen, Tiere durch Produktion von Antigenen und an¬ schließende Immunreaktion, d.h. Bildung von spezifischen Antikörpern, gegen Virus- und andere infektiöse Erkrankungen zu immunisieren.
    权利要求:
    ClaimsP a t e n t a n s p r ü c h e
    1. Eukaryotische Zellen mit einem Gehalt an durch Lipid vesikel eingebrachter DNA.
    2. Eukaryotische Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß die DNA einsträngig ist.
    3. Eukaryotische Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß die DNA doppelsträngig ist.
    4. Eukaryotische Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß die DNA prokaryotischen Ursprungs ist.
    5. Eukaryotische Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß die DNA eukaryotischen Ursprungs ist.
    O .• V/ff
    6. Eukaryotische Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die DNA eine durch reverse Transkription aus RNA hergestellte DNA ist.
    7. Eukaryotische Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die DNA eine ganz oder teilweise chemisch er¬ zeugte DNA ist.
    8. Eukaryotische Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekenn- zeichnet, daß die DNA eine an ein Plasmid angekoppelte DNA ist.
    9. Eukaryotische Zellen nach Anspruch 1, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die DNA eine an ein Virus-Genom angekoppelte DNA ist.
    10. -Eukaryotische Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryotischen Zellen Zeil-Linien sind.
    11. Eukaryotische Zellen nach einem der Ansprüche 1 - bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryotischen Zellen primäre Zellkulturen sind.
    12. Eukaryotische Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryotischen Zellen pflanzliche Seilen sind.
    13. Eukaryotische Zellen nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die eukaryotischen Zellen Protoplasten aus Pflanzen oder Bäckerhefe sind.
    14.' Eukaryotische Zeil-Linien, gekennzeichnet durch einen Gehalt an in die Ausgangszeilen durch Lipidvesikel einge- brachter DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
    15. Vielzellige eukaryotische lebende Organismen mit ein Gehalt an durch Lipidvesikel eingebrachter DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
    16. Organismen nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus eine Pflanze ist.
    17. Organismen nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus ein Tier ist.
    18. Organismen nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus ein Warmblüter ist.
    19. Organismen nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus ein Säuger ist.
    20. Organismen nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus ein Mensch ist.
    21. Verfahren zur. Herstellung eukaryotischer Zellen mit einem Gehalt an für mindestens ein Gen-Produkt codierende DNA, dadurch gekennzeichnet, daß man DNA-haltige Lipid¬ vesikel gemäß Anspruch 1 bis 9 in die Zellen einbringt.
    « 22. Verfahren zur Herstellung vielzelliger eukaryotische lebender Organismen mit einem Gehalt an mindestens für ei Gen-Produkt codierender DNA, dadurch gekennzeichnet, daß man DNA-haitige Lipidvesikel gemäß Anspruch 1 bis 9 in den Organismus einbringt.
    23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, d man als Organismus ein Tier verwendet und die DNA-halti¬ gen Lipidvesikel parenteral appliziert.
    24. verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, d man als Organismus Warmblüter verwendet.
    25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus Säuger verwendet.
    26. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß man als Organismus Menschen verwendet.
    27. Verfahren zur Herstellung von Gen-Produkten, dadurch gekennzeichnet, daß man in die eukaryotischen Zellen oder eukaryotischenProtoplasten DNA-haltige Lipidvesikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 einbringt und das primäre oder sekundäre Gen-Produkt isoliert.
    28. Verfahren zur Herstellung von Gen-Produkten, dadurch gekennzeichnet, daß man Pflanzen oder Tieren DNA-haltige Lipidvesikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 systemisch bzw. parenteral appliziert und aus den Pflanzen oder Tieren das primäre oder sekundäre Gen-Produkt isoliert.
    29. Verwendung DNÄ-haltiger Lipidvesikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Herstellung von primären oder sekun¬ dären Gen-Produkten in eukaryotischen Zellen, eukaryotischen Protoplasten oder vielzelligen eukaryotischen lebenden Organismen.
    30. Verwendung DNA-haltiger Lipidvesikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Immunisierung von Warmblütern.
    31. Verwendung DNA-haitiger Lipidvesikel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei denen die DNA für ein Gen-Produkt codiert, das eukaryotischen Zellen, eukaryotischen Proto¬ plasten oder vielzelligen eukaryotischen lebenden Organis¬ men fehlt, zur Behebung der entsprechenden genetisch be¬ dingten Defekte.
    θMPI_
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    JPS56501628A|1981-11-12|
    DE2942780A1|1981-05-21|
    CA1169793A|1984-06-26|
    CA1169793A1||
    EP0027662A1|1981-04-29|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1981-04-30| AK| Designated states|Designated state(s): JP |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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